Desarrollo de la técnica de inmunofluorescencia para la detección de antígeno del virus de Zika en semen

Abstract

RESUMEN Desarrollo de la técnica de Inmunofluorescencia para la detección de antígeno del virus de Zika en semen. Luis Hernán Vanegas Solís Br, Jinnett Toruño Morales Br, Fredman González MSc, Filemón Bucardo PhD Carrera de Bioanálisis Clínico, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Médicas, UNAN-León. La principal forma de transmisión del Zika es mediante la picadura de mosquitos, pero la transmisión materno-fetal y sexual también se ha demostrado mediante la detección del ARN viral y partículas potencialmente infecciosas en semen. El diagnóstico confirmatorio de la infección se basa únicamente en la detección del ARN viral mediante RT-PCR. El objetivo de este estudio fue optimizar una técnica de inmunofluorescencia para la detección de antígeno del virus de Zika en semen. Este estudio involucro, la optimización de los siguientes parámetros técnicos de la Inmunofluorescencia: 1) Conservación de la muestra (tiempo, temperatura y tipo de solución buffer). 2) Celularidad (recuento de células por campo). 3) Solución de fijación de la muestra (acetona, metanol o para-formaldehído al 4%). 4) Titulación del anticuerpo anti-Flavivirus (4G2) y el anticuerpo conjugado (Alexa 488 mouse). 5) Titulación de la solución de contraste (azul de Evans). 6) Tiempos de lavado (1, 2 o 3 lavados de 5 minutos con PBS 1X); y los parámetros de calidad mediante un panel a ciegas de 32 muestra semen y para obtener los cálculos de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y razón de verosimilitud de la técnica se comparó con los resultados de RT-PCR como Gold Estándar. Los resultados indican que la conservación ideal del semen es a temperaturas de -20°C y -80°C en todas las soluciones y a 4°C en las soluciones de formalina al 37% y paraformaldehído al 4% ya que en ellas los espermatozoides permanecen permeables y se conserva su estructura. La celularidad óptima por campo (objetivo de 100X) se obtiene diluyendo la muestra 1:2 con PBS 1X para obtener un promedio de 94  10 espermatozoides en un campo de 100X. La fijación ideal es paraformaldehído al 4% por 5 minutos a una temperatura de 4°C. La titulación para ambos anticuerpos es 1/200 y 30 minutos de incubación en cámara humedad a una temperatura de 37°C. Se utilizó como inción de contraste azul de Evans a una concentración de 0.312gr/ml por 3 minutos a temperatura ambiente y 3 lavadas por 5 minutos con PBS 1X en una cubeta coplin. Una vez optimizados todos los parámetros técnicos se procedió a realizar el panel a ciega donde se analizaron 32 muestra de semen obteniendo 9 (28.1%) muestras positivas por inmunofluorescencia, 11 (34.4%) muestra positivas por RT-PCR y 5 (15.6%) muestras positivas por ambos métodos. El promedio de células espermáticas infectadas por el virus del Zika fue de 1.26% con una Desviación Estándar de 4.51. La excreción de partículas virales en dos pacientes fue detectada hasta el día 28 después de iniciados los síntomas. La Sensibilidad de la prueba es de 62.5% y la Especificidad 83.3%. La Razón de Verosimilitud Positiva es de 3.74 y La Razón de Verosimilitud Negativa es de 0.45. El Valor Predictivo Positivo es de 55.5%, El Valor Predictivo Negativo es de 86.95% y el Valor Predictivo Global es de 78.12%. En conclusión hemos logrado optimizar todos los parámetros técnicos para identificar antígenos del virus del Zika en células espermáticas mediante inmunofluorescencia. Esta técnica es una alternativa a los métodos moleculares y serológicos utilizados en la investigación de la infertilidad por el virus del Zika.